摘  要：采用Alcalase和Flavourzyme兩種蛋白酶對(duì)鮑魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，利用鮑魚(yú)酶解物制備得到的增味劑，經(jīng)感官評(píng)定，具有顯著的口感增強(qiáng)作用。

關(guān)鍵詞：蛋白酶  鮑魚(yú) 增味

Study on the flavor enhancer prepared by enzymatic abalone

（GuangDong ADD Flavour ＆Fragrance CO.,Ltd.，GuangZhou 510990）

Ren Yanyan

Abstract: Alcalase and Flavourzyme were used to hydrolyze the protein of abalone. The abalone hydrolysate was prepared for flavor enhancer, which proved to have high flavor-enhance effect by sensory evaluation.

Key words: Protease; Abalone ; Flavor enhancer

    鮑魚(yú)是名貴的水產(chǎn)珍品，食用部分主要以腹足為主，其肉質(zhì)細(xì)嫩，鮮而不膩，營(yíng)養(yǎng)豐富。鮑魚(yú)中可提取的水溶性含氮化合物有：游離氨基酸、肽類(lèi)、核苷酸、有機(jī)堿和相關(guān)化合物，此外,不含氮的化合物有：糖、有機(jī)酸和無(wú)機(jī)物，以及其它的化合物如維生素、礦物質(zhì)和色素等,這些非揮發(fā)性成分是鮑魚(yú)鮮美口感的主要來(lái)源[1] 。

    在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，鮑魚(yú)在特定的酶解條件下，其酶解產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的鮮味、濃厚味口感增強(qiáng)作用，不僅體現(xiàn)在本身特征風(fēng)味的增強(qiáng)，而且對(duì)其它呈味體系諸如味精——I+G鮮味溶液以及其它肉類(lèi)呈味料，均有良好的增味作用。本研究主要從工業(yè)化生產(chǎn)角度,考慮到實(shí)際生產(chǎn)的可行性和產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用效果，為咸味香精及復(fù)合調(diào)味料行業(yè)提供一種天然、安全、健康的增味劑。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

    干鮑魚(yú)（干制皺紋盤(pán)鮑，產(chǎn)地：大連）。其它化學(xué)試劑為分析純。

    蛋白酶：堿性蛋白酶Alcalase（2.4AU/g）；風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme（500LAPU/g），生產(chǎn)廠家：NovoNordisk。

    實(shí)驗(yàn)設(shè)備：干燥箱；電子天平；722可見(jiàn)分光光度計(jì)；PHS-2C型酸度計(jì)；電熱恒溫水浴鍋；電動(dòng)攪拌器；離心機(jī)；膠體磨；小型噴霧干燥設(shè)備。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各項(xiàng)成分的測(cè)定方法[2] ：

    水分的測(cè)定：直接干燥法；灰分的測(cè)定：高溫灼燒法；總氮的測(cè)定：凱氏定氮法；脂肪的測(cè)定：索氏提取法；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：電位滴定法；總糖的測(cè)定：蒽酮比色法；

    TCA可溶性氮（TCA-N）的測(cè)定[3]：5mL酶解液與5mL 10%TCA（三氯乙酸）混合后靜置30分鐘，3000r/min離心15分鐘得上清液，凱氏定氮法測(cè)定上清液中氮含量。

    TCA可溶性肽得率（%）= TCA-N得率 - 氨基酸態(tài)氮得率（%）

1.2.2鮑魚(yú)酶解工藝及增味劑的制備

    干鮑魚(yú) → 清洗 → 絞碎 → 加水（比例為1：8）→ 過(guò)膠體磨 →100℃蒸煮20分鐘 → 降溫至55℃,加入堿性蛋白酶Alcalase（加酶量0.1%）→ 酶解1小時(shí)后，加入風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme（加酶量0.1%）→ 繼續(xù)保溫酶解4小時(shí)→ 95℃，10分鐘滅酶。

    分別取酶解時(shí)間為1h、2h、3h及4h的酶解液，加入10%的麥芽糊精，85℃保持20分鐘，然后過(guò)膠體磨，再經(jīng)噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)195℃，出風(fēng)95℃）得鮑魚(yú)增味劑。

1.2.3 鮑魚(yú)增味劑感官評(píng)價(jià)方法

    將不同酶解時(shí)間制備的增味劑分別按0.1%的添加量，加入到鮮味溶液（谷氨酸鈉0.2g、5’-呈味核苷酸二鈉0.02g、食用鹽0.5g，溶于100g 70℃的水）中。同時(shí)做空白對(duì)比。

    Friedman排序檢驗(yàn)法：7名經(jīng)驗(yàn)豐富的感官評(píng)定員，對(duì)5個(gè)樣品按鮮味、濃厚味或嗜好程度對(duì)樣品進(jìn)行排序。使用Friedman排序檢驗(yàn)對(duì)樣品之間是否有顯著性差異做出判定[4]。

表1排序法問(wèn)答表

2結(jié)果與討論

2.1 鮑魚(yú)成分分析

    由表1可以看出，鮑魚(yú)營(yíng)養(yǎng)豐富，若按干基計(jì)算，其粗蛋白含量為57.36%，脂肪含量4.12%,是優(yōu)質(zhì)的低脂高蛋白質(zhì)資源。

表2 鮑魚(yú)主要成分分析

    另?yè)?jù)報(bào)道，鮑魚(yú)不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，還富含多種生理活性物質(zhì)如EPA、DHA、?；撬帷⒊趸锲缁傅?。研究發(fā)現(xiàn)從鮑魚(yú)肌肉中提取的水溶性多糖——鮑魚(yú)多糖（abalone polysaccharide,AP）具有明顯的抗腫瘤活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的作用。鮑魚(yú)肌肉蛋白酶解物還能顯著提高小鼠機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力和抗應(yīng)激能力，同時(shí)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有明顯增強(qiáng)作用[5]。因此，本研究制備的增味劑又被賦予了一定的保健功能。

2.2 鮑魚(yú)酶解液中酶解產(chǎn)物隨時(shí)間的變化

    Alcalase（堿性蛋白酶）是由細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)水解酶，主要成分草桿菌蛋白酶A，是一種內(nèi)切蛋白酶。Flavourzyme（風(fēng)味蛋白酶）是一種真菌蛋白酶/肽酶的復(fù)合體，包含內(nèi)切酶和外切酶。日本學(xué)者好井久雄指出：內(nèi)切酶幾乎沒(méi)有生成氨基酸的能力，它們只能將蛋白質(zhì)分解成多肽、水溶性蛋白質(zhì)及微量的氨基酸，而外切酶（氨肽酶和羧肽酶）才顯示出生成氨基酸的能力[6]。

    游離氨基酸是鮑魚(yú)酶解液中的主要呈味成分，它們的含量和比例決定了酶解物的風(fēng)味特征和增味作用。由圖1可以看出，在酶解開(kāi)始的一小時(shí)內(nèi)，氨基酸態(tài)氮并無(wú)明顯增加，而TCA可溶性氮?jiǎng)t增加顯著，這是由Alcalase的作用特性決定的。在酶解2～5小時(shí)，在Alcalase和Flavourzyme兩種酶的共同作用下，氨基酸態(tài)氮和TCA可溶性氮的量都有增加，但是氨基酸態(tài)氮的增加非常緩慢，這與Flavourzyme中外切酶的活力有直接關(guān)系。

圖 1 鮑魚(yú)酶解液中酶解產(chǎn)物隨時(shí)間的變化

2.3 鮑魚(yú)酶解液TCA可溶性肽得率的變化

    酶解過(guò)程中產(chǎn)生的肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)酶解產(chǎn)物的呈味也有重要的影響，它們對(duì)食品基本味感和特種風(fēng)味的影響主要是通過(guò)與食品的各種呈味成分發(fā)生相乘作用，而使食品是總體味感變得協(xié)調(diào)、細(xì)膩，起到增味劑的作用[7]。

圖2 鮑魚(yú)酶解液TCA可溶性態(tài)肽得率的變化

    有研究顯示，用細(xì)菌蛋白酶作用得到的酶解產(chǎn)物，分子量小于2500Da的寡肽較多，而來(lái)自動(dòng)物的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中分子量較大的多肽比較多[8]。由于蛋白酶作用位點(diǎn)的位置及數(shù)量的不同，會(huì)造成酶解片斷分子量大小的差異和氨基酸組成的變化。

    由圖2 可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，TCA可溶性氮的得率逐漸提高，在酶解1～3小時(shí)有非常顯著的增加，但隨后增加緩慢。TCA可溶性肽得率則在酶解3小時(shí)之前增加，在之后開(kāi)始減少，這是因?yàn)镕lavourzyme中外切酶的持續(xù)作用，從肽鏈的末端逐步切下氨基酸，使得酶解液中游離氨基酸增加，而TCA可溶性肽的含量有所減少。

2.4 鮑魚(yú)增味劑增味特性比較

    如表3所示，將不同酶解時(shí)間制備的增味劑和空白的鮮味溶液分別編號(hào)，由七名有經(jīng)驗(yàn)的感官評(píng)價(jià)員對(duì)5個(gè)樣品按鮮味、濃厚味或嗜好程度對(duì)樣品進(jìn)行排序。

表3 七名評(píng)價(jià)員對(duì)5個(gè)樣品的排序結(jié)果

    采用Friedman檢驗(yàn)對(duì)五個(gè)樣品之間的差異作出判定。

式中：J—評(píng)價(jià)員數(shù)

P—樣品數(shù)

R1、R2……RP—J個(gè)評(píng)價(jià)員對(duì)P個(gè)樣品評(píng)價(jià)的秩和

計(jì)算得F＝18.26。查表可知，在0.05顯著水平上，臨界值α（5，7）＝9.49＜F=18.26，所以樣品間存在顯著差異，再對(duì)其差異程度進(jìn)行檢驗(yàn)。樣品按秩和由小到大排序?yàn)椋篟D、RE、RC、RB、RA,其數(shù)值分別為：10、12.5、23、25.5、33。

計(jì)算臨界值：

I=2，3，……P，q(I,α)可查表得到

RA－RD＝33-10=23＞γ(5,0.05)=16.13

RB－RD＝25.5-10=15.5＞γ(4,0.05)=15.17

RA－RE＝33-12.5=20.5＞γ(4,0.05)=15.17

RB－RE＝25.5-12.5=13＜γ(3,0.05)=13.84

RA－RC＝33-23=10＜γ(3,0.05)=13.84

RC－RD＝23-10=13＜γ(3,0.05)=13.84

RE－RD＝12.5-10=2.5＜γ(2,0.05)=11.58

將以上結(jié)果比較，表示為：D E C B A

    通過(guò)以上分析，在5％的顯著水平上，D樣品鮮味、濃厚味和協(xié)調(diào)性最佳，E與D無(wú)明顯差異，其次是C和B樣品，二者也無(wú)明顯差異，最次是空白的味精——I+G溶液，其鮮味和口感比較單一，回味差。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇酶解時(shí)間為3小時(shí)，制備的增味劑具有顯著的口感增強(qiáng)作用。

3結(jié)論

    采用Alcalase和Flavourzyme兩種酶，對(duì)鮑魚(yú)進(jìn)行分段加酶酶解，所得酶解物含有大量游離氨基酸和TCA可溶性肽，制備得到的鮑魚(yú)增味劑，經(jīng)感官評(píng)定，具有顯著的鮮味、濃厚味增強(qiáng)作用?？蓮V泛應(yīng)用于各種肉類(lèi)呈味料、海鮮呈味料和復(fù)合調(diào)味料中。

    由于氨基酸和肽類(lèi)呈味原理的復(fù)雜性，有必要對(duì)鮑魚(yú)酶解物中游離氨基酸組分以及肽分子量的分布做進(jìn)一步的研究，以期找到其內(nèi)在規(guī)律，為咸味香精的研發(fā)和生產(chǎn)提供理論支持，這是我們研究的重要方向。

參考文獻(xiàn)：

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[8]Gildberg A, Arnesen J A, Carlehog M. Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation.Process Biochemistry,2002,38:475～480

作者簡(jiǎn)介：任艷艷（1979-），女，碩士，主要從事咸味香精基礎(chǔ)原料的開(kāi)發(fā)與研究。